李红莉，周铁锋，毛宇骁，黄海涛，崔宏春，郑旭霞，赵芸
西湖龙井产区茶树炭疽菌分离鉴定及其植物源抑菌剂筛选
李红莉，周铁锋*，毛宇骁，黄海涛，崔宏春，郑旭霞，赵芸*
杭州市农业科学研究院，浙江 杭州 310024
为筛选出对西湖龙井产区茶树炭疽病菌具有较好抑菌活性的植物提取物，对该地区的茶树炭疽病菌进行了分离鉴定，采用菌丝生长速率法测定了12种植物提取物的抑菌活性，进一步采用浓度梯度试验测定了3种抑菌活性较好的植物提取物的抑菌毒力。研究结果表明，引起西湖龙井产区茶树炭疽病的主要病原为山茶炭疽菌（）；
在200 mg·L-1时香荆芥酚、牛至精油和紫苏醛对该菌的抑菌活性较好，菌丝生长抑制率均在68%以上，有效中浓度（EC50）分别为71.459、77.155、110.753 mg·L-1。显微观察发现，在添加有效中浓度的香荆芥酚、牛至精油和紫苏醛的培养基上进行病原菌培养时，菌丝形态发生明显改变，呈现变形扭曲、皱缩干瘪等现象。综上所述，香荆芥酚、牛至精油和紫苏醛对山茶炭疽菌具有较强的抑菌活性，具有开发为植物源杀菌剂的应用潜力。
茶树；
炭疽菌；
植物提取物；
抑菌活性；
毒力测定
茶树[（L.）O. Kuntze]起源于中国，茶叶中富含茶多酚、咖啡碱、茶氨酸等多种功能性成分，具有良好的保健功效，深受消费者喜爱[1-2]。茶树病虫害是茶叶高产优质的重要限制因素，其中炭疽病是茶树叶部的主要真菌病害之一，在我国各茶区均有发生。西湖龙井茶产区温暖湿润的气候利于炭疽病发生蔓延，主栽品种龙井43易感炭疽病，近年来发病率逐年上升[3]。受害茶树叶片轻则出现灼烧状病斑，重则造成大面积叶片脱落和植株枯死，严重影响树势和茶叶品质，造成巨大的经济损失[4-5]。我国已报道的茶树炭疽菌有16个种及1个未鉴定种，包括异国炭疽菌（）、隐秘炭疽菌（）、尖孢炭疽菌（）和博宁炭疽菌（）等[6]。不同种的炭疽菌具有不同的地域分布，对茶树的致病力及对防治药剂的敏感性存在一定的差异，因此明确茶树炭疽菌的种类是开展防治技术研究及抗病品种选育的关键。
目前防治茶树炭疽病仍以喷施苯并咪唑类、三唑类等化学农药为主，不仅防效难以保障，还易引起茶叶农残超标、病原菌抗药性增强及茶园生态环境破坏等一系列问题。近年来，农药残留超标已成为影响我国茶叶出口的主要因素之一[7]。针对茶树病虫害开发绿色高效的生物农药迫在眉睫。植物提取物因其源于自然植物资源，具有环保低毒、易降解、对非靶标生物相对安全及不易产生抗性等优点，其相关研究越来越受到人们的重视[8]。目前，研究报道较多的天然植物提取物主要有挥发油（精油）、黄酮类、生物碱、多糖类等。植物精油是存在于芳香植物的叶、根、皮、花和果中的一类重要的次生代谢产物。其成分主要包括萜类化合物、芳香族化合物、脂肪族化合物和含氮含硫化合物等[9]。很多研究表明，植物提取物具有抑菌、杀虫、杀螨、驱虫和抗氧化等活性[10-12]。在美国、以色列等很多国家均有植物提取物类农药投入市场，用于温室作物、园林花卉的病虫害防治。本研究从西湖龙井茶产区龙井43茶园的炭疽病叶片中分离优势致病菌，通过传统形态学方法并结合多基因系统发育分析对病原菌进行鉴定，以分离得到的山茶炭疽菌（）为靶标，采用菌丝生长速率法测定12种植物提取物对山茶炭疽菌的抑菌活性，筛选出3种效果相对较好的植物提取物进行抑菌毒力测定，并通过显微观察初步探究其抑菌机理，以期为茶树炭疽病天然绿色农药的研制提供参考。
1.1 试验材料
供试茶树炭疽病病叶于2021年6月在梅家坞、龙井村等西湖龙井茶主产区的龙井43茶园采用五点取样法采集。
试验中所用的百里香精油（百里香酚含量＞40%）、柠檬精油（98%）、肉桂精油（85%）、牛至精油（98%）、柑橘精油（98%）、香茅精油（98%）、薰衣草精油（98%）、薄荷油（98%）、紫苏醛（≥95%）、香荆芥酚（HPLC 92.5%）、柠檬醛（95%）、肉桂醛（HPLC≥98%）均购自上海源叶生物科技有限公司。
Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司，2×Taq PCR MsaterMix购自天根生化科技（北京）有限公司。本研究所用培养基为马铃薯葡萄糖琼脂（Potato dextrose agar，PDA）培养基。
1.2 试验方法
1.2.1 病菌的分离纯化
采用组织分离法[13]进行病原菌分离。将新鲜采摘的茶树病叶冲洗30 min，晾干后在病健交界处剪取5 mm×5 mm组织块，分别用75%乙醇和5%次氯酸钠消毒后用无菌水冲洗3次，在无菌滤纸上晾干后置于PDA固体培养基上，在25 ℃培养箱中培养3 d长出菌丝后取菌落边缘的菌丝块转接到新鲜的PDA平板中央，重复此操作数次直至获得纯培养物。
1.2.2 病原菌的形态学观察
在纯化后的菌落平板边缘打取直径5 mm的菌丝块接种于PDA平板中央，置于26 ℃下培养7 d，定期观察病原菌菌落特征及孢子形态，计算菌落生长速度，并通过柯赫氏法则（Koch’s Rule）将分离病原菌进行初步回接侵染验证。
1.2.3 病原菌的分子鉴定
采用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒提取病原菌基因组DNA，对分离物DNA的核糖体内转录间隔区（Internal transcribed spaces，ITS），钙调蛋白（Calmodulin，CaM）基因，肌动蛋白（Actin，ACT）基因，3-磷酸甘油醛脱氢酶（Glyceraldehyde-3- phosphate dehy-drogenase，GAPDH）基因、-微管蛋白（Beta-tubulin，TUB2）基因进行PCR扩增，引物序列、退火温度等见表1。反应体系及组分为：10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP 1 μL，Taq酶0.2 μL，10 μmol·L-1引物（正向和反向）各0.5 μL，DNA模板0.5 μL，补足dd H2O至25 μL。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，所得序列纯化后送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。将测得的序列在NCBI中利用BLAST进行序列同源性分析，下载参考序列通过DNAMAN软件按照ITS-ACT-GAPDH- CAL-TUB2基因顺序拼接，参考序列登录号参考文献[14]，以CBS 123755作为外类群，利用MEGA 7软件最大似然法（Maximum Likelihood，ML）构建系统发育树，bootstrap设定为1 000。
1.2.4 分离病原菌的致病性鉴定
取健康的龙井43新梢从上往下数的第1～5叶位叶片作为一组处理，经无菌水冲洗后自然晾干，用75%乙醇进行擦拭，将叶片表面划伤后，用直径5 mm打孔器打取菌饼，将长有菌丝的一面放于伤口处进行接种，以接种无菌PDA培养基块及无伤接种病原菌作为对照，将接种后的叶片置于26 ℃恒温箱中进行培养，定期观察不同叶位叶片的发病情况。对接种发病的叶片，再次按照1.2.1章节的方法分离纯化致病菌，观察其与原接种分离物是否一致。
表1 茶树炭疽病病原菌鉴定所用引物
1.2.5 抑菌活性的测定
以从茶园分离得到的茶树炭疽病菌为研究对象，采用菌丝生长速率法[15]测定12种植物提取物对菌丝生长的抑制作用。将植物提取物与等体积的乳化剂吐温80混合后加灭菌水配成20 g·L-1的母液，使用时用灭菌水稀释到所需浓度（2 g·L-1和4 g·L-1）。将2 mL一定浓度的植物提取物加入到刻度试管中，再用灭菌后冷却至50 ℃左右的PDA培养基定容至20 mL，充分混匀后倒入90 mm培养皿中配成培养基平板，以不含植物提取物的平板为对照，每个处理重复3次，所有制剂现用现配。将黑暗培养5 d的供试病原菌用5 mm打孔器打取长势相同的菌饼，带有菌丝的一面朝下接入培养基中央，置于26 ℃恒温培养7 d后用十字交叉法测量各处理的菌落直径，按照下列公式计算菌丝生长抑制率：
式中，ck为对照菌落直径，b为菌饼直径，t为处理菌落直径。
1.2.6 对茶树炭疽病菌有效中浓度（EC50）的测定
根据1.2.5章节的初筛试验结果，选择抑菌活性较好的3种植物提取物，按照质量浓度梯度制作PDA平板，紫苏醛的质量浓度为50、100、150、200、250 mg·L-1；
香荆芥酚的质量浓度为20、40、60、80、100 mg·L-1；
牛至精油的质量浓度为50、60、70、80、100 mg·L-1。采用菌丝生长速率法测定各质量浓度植物提取物对茶树炭疽病菌的菌丝生长抑制率，每个处理重复3次。以植物提取物质量浓度的对数为自变量，菌丝生长抑制率为因变量，计算出毒力回归方程和相关系数（2），根据回归方程求出EC50值。
1.2.7植物提取物对茶树炭疽病菌菌丝形态的影响
将抑菌活性较好的3种植物提取物按照EC50浓度制作PDA平板，取5 mm长势相同的炭疽菌菌饼接种到培养基中央，26 ℃恒温培养7 d后，在显微镜（Eclipse 80i，Nikon，Japan）下观察菌丝形态特征，以不添加植物提取物的PDA平板为对照。
1.2.8 数据处理
采用Excel 2010和SPSS 17.0对试验数据进行处理。抑菌率用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析，采用Duncan氏新复极差法进行差异显著性分析。
2.1 田间症状观察及致病菌分离纯化
田间观察发现，炭疽病发生时初为暗绿色水渍状病斑，后逐渐扩展为黄褐色病斑，最后变为灰白色枯斑，其上生有粒状黑色小颗粒，为病原菌的分生孢子盘，个别大型枯斑有时可跨过中央叶脉蔓延至整叶（图1）。
采用五点取样法，在种植龙井43的西湖龙井茶主产区的茶园采集新近发病的茶树叶片，并对叶片上的病原菌立即进行分离，纯化4～5次后，得到该病原菌的纯培养物。参照分离获得的真菌培养性状和菌落形态，在茶树病叶上共分离获得8个真菌菌株。经初步回接验证，结果显示，HZ-A8的致病性最强，由此对其开展后续研究。经形态学观察发现，HZ-A8在PDA培养基上培养7 d，其生长速率为11.6～12.9 mm·d-1，菌落呈圆形，边缘整齐，气生菌丝致密，绒毛状，初为白色后为灰白色，背面白色至灰白色（图2）。显微镜下分生孢子透明，圆柱状，无隔膜，两端钝圆。分生孢子大小为(12.62～19.61) μm×(4.75～5.69) μm。
2.2 致病性分析
采用有伤和无伤接种的方法对菌株HZ-A8的致病性进行测定，接种2 d后，有伤接种的茶树叶片上产生了红褐色病斑，边缘有水渍状晕圈（图3）。其中第1～3叶位叶片上的病斑更为明显。通过观察和测量病斑面积，发现幼嫩叶片中病斑面积更大，扩展更快，而第4～5叶位相对成熟的叶片病斑面积小（图3）。将病斑组织用PDA培养基重新进行分离培养，获得的菌落形态和原接种菌株HZ-A8一致，结果符合柯赫氏法则。无伤接种HZ-A8及有伤接种PDA培养基的对照组叶片未出现病斑。
图1 茶树炭疽病叶片症状（从左至右症状由轻到重）
注：a，正面；
b，背面
图3 有伤接种后茶树叶片上的病斑
2.3 分离菌株的多基因系统发育分析
相关序列根据ITS-ACT-GAPDH-CAL-TUB2的5个基因顺序拼接后，构建多基因系统发育树（图4）。右图4可知，所分离到的菌株HZ-A8与山茶炭疽菌（）聚为一类，自展值为100。因此，结合病原菌的形态特征和分子生物学鉴定结果，确定所分离获得的菌株HZ-A8为山茶炭疽菌。
2.4 12种植物提取物对茶树炭疽病菌菌丝生长的抑制作用
以菌丝生长速率法测定了200 mg·L-1和400 mg·L-1两种质量浓度处理下，12种植物提取物对HZ-A8菌丝生长的抑制作用，结果如表2所示。在质量浓度为200 mg·L-1时，香荆芥酚、牛至精油对茶树炭疽病菌菌丝生长的抑制率最高，达到了100%；
其次为紫苏醛，抑菌率为68.37%。在质量浓度为400 mg·L-1的条件下，香荆芥酚、牛至精油、紫苏醛和肉桂精油的抑菌率均达到100%；
该质量浓度下，除了柑橘精油、柠檬精油和薰衣草精油的抑菌作用较弱（抑菌率小于10%），其余5种植物提取物对茶树炭疽病菌也表现出一定的抑菌活性。综合抑菌效果前5的精油为香荆芥酚、牛至精油、紫苏醛、肉桂精油和百里香精油。
注：分支上的数值为1 000次重复后等于或高于50%的bootstrap值；
C. boninense CBS 123755为外类群
2.5 植物提取物对茶树炭疽病菌的毒力测定
根据2.4章节的试验结果，得出香荆芥酚、牛至精油和紫苏醛3种植物提取物对茶树炭疽病菌具有较好的抑菌活性，采用浓度梯度法进一步测定其抑菌率，依据试验结果拟合出各提取物的毒力回归方程，并计算出EC50值。由表3和图5可知，3种植物提取物的抑菌效果都随着浓度的增加而逐渐增强，相关系数均大于等于0.92，说明其浓度和菌丝生长抑制率间存在较好的线性关系。3种植物提取物对茶树炭疽病菌的EC50在71.459～110.753 mg·L-1，其中香荆芥酚的毒力强度最大，EC50值为71.459 mg·L-1；
其次为牛至精油，EC50值为77.155 mg·L-1；
紫苏醛的抑制作用略差，EC50值为110.753 mg·L-1。
2.6 植物提取物对茶树炭疽病菌菌丝形态的影响
显微观察结果如图6所示，对照组菌丝生长正常，形态完整饱满，而经牛至精油、香荆芥酚和紫苏醛处理的培养基上生长的菌丝形态发生了明显的变化，菌丝呈现不同程度的变形扭曲、粗细不匀，甚至出现内含物消解，菌丝皱缩干瘪等现象，表明3种植物提取物通过破坏菌丝形态结构，改变其生长状态来抑制菌落的扩展。
炭疽病致病菌种类繁多，不同种间的致病力和生物学特性存在一定差异。本研究通过形态学观察、多基因聚类分析和柯赫氏法则验证，明确西湖龙井茶产区茶园所分离到的炭疽病原菌主要为山茶炭疽菌（），接种茶树叶片显示其具有较强的致病力。山茶炭疽菌在我国福建、浙江、江西、陕西、贵州等大部分茶区均有分布[14]。Wang等[16]从中国15个主要产茶省的茶树病叶上共分离到106株炭疽菌，发现是危害中国茶树的优势致病种。贡长怡等[17]对12个省份的茶树炭疽病菌进行鉴定，发现山茶炭疽菌和果生炭疽菌的分离频率较高。本研究对西湖龙井茶区炭疽病病原菌进行分离鉴定，明确优势菌种，这对于有针对性地开展防治技术研究具有重要意义。
表2 12种植物提取物对茶树炭疽菌的抑菌活性
注：表中数据为平均值±标准误，同列中不同小写字母表示差异显著（＜0.05），同列中不同大写字母表示差异极显著（＜0.01）
Note: All results were expressed as mean±standard deviation. Different small letters in the same column indicate significant difference at 0.05 level. Different capital letters in the same column indicate significant difference at 0.01 level
表3 3种植物提取物对茶树炭疽病菌的毒力
注：紫苏醛从左至右质量浓度为50、100、150、200、250 mg·L-1；
牛至精油从左至右质量浓度为50、60、70、80、100 mg·L-1；
香荆芥酚从左至右质量浓度为20、40、60、80、100 mg·L-1
注：A，对照；
B，77.155 mg·L-1牛至精油处理；
C，71.459 mg·L-1香荆芥酚处理；
D，110.753 mg·L-1紫苏醛处理
作为植物重要的次生代谢物质，植物提取物在多种蔬菜、水果和作物上被证实具有很强的杀菌活性[18-20]。薰衣草精油[21]、肉桂精油[22]、百里香精油[23]等已广泛应用于果蔬保鲜领域。在植物保护方面国内外学者也进行了大量研究，并筛选到一些具有较好抑菌杀虫活性的植物提取物。孙伟[24]鉴定了101种植物提取物对苹果腐烂病菌（）和棉花立枯病菌（）的生物活性情况，发现苦参、狼毒、藿香等多种植物提取物对两种病菌的抑制效果都在80%以上。在茶树研究方面，孙钦玉等[25]发现，紫苏和薄荷提取物在40 mg·mL-1质量浓度下对茶炭疽病菌菌丝生长抑制率均在75%以上。芦柑皮、艾蒿、香樟叶和侧柏叶对茶炭疽病菌的96 h EC50分别为8.981、839.575、1 058.682、1 429.094 mg·L-1[26]。本研究采用菌丝生长速率法测定了12种植物提取物对茶树炭疽病菌的抑菌活性，筛选出的香荆芥酚、牛至精油和紫苏醛在质量浓度为200 mg·L-1时对茶树炭疽病菌菌丝生长的抑制率可达到65%以上。毒力测定显示，香荆芥酚和牛至精油的EC50均低于80 mg·L-1，与上述茶树炭疽病菌研究结果相比，其抑菌活性仅次于芦柑皮，且优于其他报道的植物提取物，由此可见香荆芥酚和牛至精油对茶树炭疽病菌具有较好的抑菌效果，具有开发成植物源杀菌剂的潜力。牛至提取物具有抑菌、杀菌及抗氧化作用，已广泛应用于食品保鲜、畜牧养殖中[27-28]。很多研究证实，牛至精油及其主要成分在较低的浓度下就有较好的抑菌及杀虫活性[28-29]。香荆芥酚是牛至中的主要抗菌成分，对腐皮镰刀菌等都具有较好的抑菌作用[30]。此外，香荆芥酚还具有较强的杀虫活性，其对苹果树红蜘蛛（）的LC50值仅为14.7 mg·L-1[31]。本研究为茶树炭疽病的绿色防控发掘了更多具有潜在开发利用价值的植物提取物。
植物提取物的抑菌机理主要包括破坏微生物的细胞膜或细胞壁结构、影响呼吸和能量代谢、抑制生物大分子的合成等[32]。大部分植物提取物成分复杂，通常具有多种抗菌机制和作用靶位，这也是其抗菌谱广、不易产生耐药性的原因之一。崔醒等[33]研究发现，香芹酚通过破坏禾谷镰刀菌（）细胞膜的完整性，引起电解质渗漏和能量代谢失衡而发挥抑菌作用。本研究通过显微观察发现，经牛至精油、香荆芥酚和紫苏醛处理后，茶树炭疽菌呈皱缩干瘪状，推测3种植物提取物能够破坏菌丝的细胞膜和细胞壁结构，使其不能正常生长。
综上所述，本研究通过菌丝生长抑制试验证实牛至精油及其主要成分香荆芥酚对茶树炭疽菌具有较好的抑菌活性。目前由于技术原因，植物精油等植物提取物的产出效率不高，并且很多物质挥发性较强，将其开发为植物源杀菌剂应用于茶园仍然面临诸多问题。下一步将深入探究牛至精油等植物提取物的活性成分和抑菌机制，研发生物农药新剂型及协同作用配方，为植物源农药在茶树病虫害防控领域的应用开发提供理论依据。
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Isolation and Identification of Anthracnose Pathogen from Xihu Longjing Plantation and Screening of Its Plant-derived Fungicides
LI Hongli, ZHOU Tiefeng*, MAO Yuxiao, HUANG Haitao, CUI Hongchun, ZHENG Xuxia, ZHAO Yun*
Hangzhou Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310024, China
In order to screen out plant extracts with better antibacterial activity against anthracnose in Xihu Longjing tea producing area, the pathogens of tea anthracnose in this region were isolated and identified, and the inhibition activities of 12 plant extracts on the identified pathogen were determined using mycelial growth rate method. Concentration gradient test was further used to determine the antibacterial virulence of the top 3 plant extracts. The results show thatwas the major pathogenic strain in the study region. At the concentration of 200 mg·L-1, the antifungal activities of vitriol, oregano essential oil and perillal aldehyde were better, and their inhibition rates on the growth of anthrax were all above 68%, and their effective medium concentrations (EC50) were 71.459, 77.155 mg·L-1and 110.753 mg·L-1, respectively. Microscopic observation shows that the mycelium morphology ofhad obvious changes in the medium when supplemented with above plant extracts, showing deformation, distortion, shrinkage and shriveled. These results indicate that carvacrol, oregano essential oil and perill aldehyde have strong antibacterial activities againstand possess potential for development as plant-derived fungicides.
tea plant, anthracnose, plant extract, antifungal activity, toxicity determination
S571.1；
S435.711
A
1000-369X(2023)02-194-11
2022-11-21
2023-01-29
杭州市农业与社会发展科研专项（20201203B93）、浙江省（茶树）农业新品种选育重大科技专项（2021C02067-4）、杭州市农科院创新基金项目（2022HNCT-04）、财政部和农业农村部：国家现代农业产业技术体系建设专项（CARS-23）
李红莉，女，农艺师，主要从事茶树病虫害绿色防控技术研究。*通信作者：14281858@qq.com；
yunzhaohao@sina.com
